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全自动生化仪之基本参数及使用
发布时间:2020-10-10   点击次数:490次
  了解生化分析仪基本参数的原理,有利于仪器、试剂的正确使用,有助于正确分析和处理测定数据。但是,配套零碎的原装分析参数不宜更改;采用非仪器配套的试剂及校准品体系时,参数修正要慎重,对于不同仪器、不同类型的反应分析程序,所显示的人机对话分析参数信息有所不同。
 
  一、反应监测时间
 
  对于起点法来说,读取反应达到平衡时的吸光度计算样品中待测物的浓度。对于连续监测法来说,要留意观察反应进程曲线,从而确定反应的预孵育期,延迟时间、连续监测的时段。对于一级或伪一级反应来说,连续监测的时间是一级反应的动态期的吸光度;对于基于零级反应的酶催化活性浓度速率法测定,连续监测的是零级线性反应期的吸光度。对于连续监测法来说,动态反应期的时间越长,越适用于临床使用,对于以酶为工具的代谢物酶促动力测定法,要添加动态反应期,即延伸反应达到平衡的时间,可在反应体系中加入竞争性抑制剂,这样还可以提高测定的线性范围,对于酶催化活性浓度连续监测法来说,一定要留意线性反应时间,有的酶,例如,以硫代丁酰胆碱为底物的血清假性胆碱酯酶速率测定法,线性反应时间只要90秒。对于连续监测法来说,在监测期至少应读4个点(3个△A)。
 
  多数全自动生化分析仪可以在整个测定反应周期连续监测(如HITACHI7170常规测定周期10分钟、监测34点,OLYMPUSAU600固定周期8分15秒、监测27点),但反应监测时间是指该时间内的测定读数要用于结果计算。它的设置与加样点、加试剂点(包括R1、R2……)、监测时间(读数点)、读数间隔时间及试剂样品比例等有关,要结合方法学,兼顾权衡。
 
  1.反应时间(ReactionTime)指仪器的一个分析周期中,试剂和样品混合末一点测定读数时间。它对起点法尤其重要,是起点法的瓶颈。有的仪器多个反应时间可选L如Hl—TACHI7170),须事后选定。多数仪器10分钟左右,这对试剂提出了较高要求。不少起点法试剂(尤其手工法试剂)反应时间常常也在lO分钟上下,测定时间没不足地,当样品浓度高或试剂质量下降时,均可致测定结果偏低。因此,起点法不宜采用标明反应时间接近和长于仪器大反应时间的试剂盒。否则,必须用接近测定范围上限的高浓度质控血清监测。
 
  2.监测时间(读数点)和读数间隔时间各类型仪器不尽分歧。离心式生化仪读数间隔时间短,监测时间也短。流动式生化仪读数间隔时间普通较长。分立式生化仪普通监测时间10分钟左右,间隔10-30秒读数一次。有的仪器在整个测定反应周期全程读数,有的只读取时间(点)的吸光度。
 
  3.加试剂点采用双试剂时,加R2点决定R1与样品的反应时间,也决定R2与R1及样品的反应时间。普通仪器各5分钟左右。HITACHI7170有4个加试剂点,若采用双试剂,各5分钟,则加R2设在第3加试剂点。
 
  4反应监测时间还要考虑延迟时间的长短、测定物质的浓度范围及相关临床价值和工作效率等要素。
 
  二、延迟时间
 
  延迟时间(DelayTime)指试剂与样品混合后到监测开始之间的时间。普通用于两点法和速率法,某些情况下也用于起点法。起点法应选择反应趋于平衡的时间(波动期或平衡期)作测定,测定点前即所谓的孵育期。速率法的线性反应期之前即延迟期。正确选择延迟时间的长短,有利于精确测定,减少试验误差。设置普通根据试剂盒的说明书,还应考虑本室的仪器特点和工作程序。
 
  1.仪器特点比如,半自动生化仪多为流动比色池,要考虑泵速、进样管长短、反应液黏稠度及混合情况,以及室温、反应液温度同反应要求温度间的温差等。全自动生化仪的测定读数设置方式不同,直接以“秒”设置,或以测定点设置、测定点间隔时间不一样,需求灵活掌握。
 
  2.试剂及方法学
 
  (1)试剂组成在酶活性的连续监测法时,若试剂含工具酶数量多、偶联反应多,则激活反应时间普通较长,延迟时间也较长,如肌酸激酶(NAC法)延迟时间常设置120-180秒;若试剂中底物经待测酶催化,其产物可以直接测定的,则延迟时间较短,如-谷氨酰转移酶(GGT)设定30-60秒。同一项目同一方法,但试剂配方不同,其反应快慢等特征也可能不同,如白蛋白测定。白蛋白与溴甲酚绿(BCG)为即时反应,10秒钟内已完成,其后球蛋白等也将与BCG发生反应,所以孵育时间不可以延伸。但在同一测定时间,BcG浓度、缓冲液品种、pH和表面活性剂不J司的试剂,测定结果可能差异明显。
 
  (2)样品异常成分干扰有的试验项目需求用工具酶将内源性代谢产物耗尽,比如丙氨酸氨基转移酶活性测定试剂中须有足量的乳酸脱氢酶(LDH)。如果使用单试剂,正常血清样品延迟时间60秒即可;但当内源性酮酸增多(如酮症酸中毒)时,试剂内LDH常常不可以在60秒内完全将其清除,剩余酮酸会进入监测期干扰测定,使测定结果偏高,所以延迟时间应增至90~120秒。采用双试剂,则可在加入R1后即进入预孵育期。
 
  (3)方法学要求比如肌酐(Jaffe法)测定的特异性不强,普通认为反应前20秒左右为乙酰乙酸等快反应干扰物呈色,后约80~100秒为蛋白质等慢反应假肌酐呈色,20~60秒肌酐呈色反应占主导地位。采用两点法或速率法可减少干扰,但具体取多长的延迟时间,应根据试剂和仪器读数特点,以干扰试验等方法来评价决定。
 
  3.工作程序要在保证精确性的前提下,合理设置参数,提高工作效率。突出的例子是半自动生化仪上酶活性连续监测法的延迟时间设定。由于只能单份样品逐一测定,若延迟时问全部设置在仪器内,每个延迟时间加监测时间至少1分钟以上,守候时间较长。工作量大时,可以根据仪器控温、加样及读数和试剂特点,以及室温情况,将延迟时问挪一部分到机外,套式操作,但要确保机内延迟时间不要进入线性反应期。
 
  4.要兼顾延迟时间和监测时间反应时间是有限制的。在速率法和两点法中,延伸延迟时间必然缩短线性监测期,减少测定的线性范围,也易发生底物耗尽。
 
  三、样品量、试剂量与浓缩量
 
  有关参数包括样品量、试剂量、浓缩水量、小反应体积和大比色杯容量等。如HITACHI7170反应体积180~380µl,大体积570µl。BT224半自动生化仪流动比色池容积33µl,吸液量200~990µl,适体积500µl。
 
  1.小反应体积在仪器光度读数要用于结果计算时,反应液液面高度不低于光度计光径的小体积。它保证仪器的正确读数和计算,也是仪器测定精度和经济性的指针之一。在有的仪器中,它以反应体积的上限表示,有的则专门标明小反应体积。在单试剂测定中,样品与试剂的总体积不得少于此参数。在双试剂测定中,若R1与样品的反应读数不纳入结果计算。R1自勺加液量可不考虑此参数,如连续监测法;否则应考虑它对结果的影响,如起点法在加R2之前读数,并以此来扣除试剂或样品空白时。
 
  在半自动生化仪中,适吸人量相当于少反应体积。它与进液管道长度、流动比色池容积,吸液泵抽吸力大小和液体黏稠度有关,它要保证光度检测不受空泡和前后样品携带净化的干扰。因此,吸人体积不可以任意降低,必要时,应加大反应液量和吸人量。
 
  2.大比色杯容量这个参数含义明确。在有的仪器中,它以反应体积的上限表示,有的则专门标明大比色杯容量。反应液超过此体积,将致液体外溢,仪器测定零碎被污损。
 
  3.样品试剂比例样品与试剂的比例(SV:RV),也可表示为样品体积分数——样品体积与反应液总体积的比值(SV/TV),是方法学基本参数。酶活力测定中,样品在总体积中的比例应在10%以下。普通来说,待测物质在样品中含量低的、生理波动范围大的,样品用量较大。如Trinder反应测定血清葡萄糖、胆固醇等,样品试剂比例多为1:1OO,测定血尿酸或高密度脂蛋白胆固醇,常添加为1:50;ALT和AST的样品试剂比例多为1:1O至1:20。方法灵敏、吸光度高的实验方法,样品试剂比例小,如白蛋白BCG法,样品试剂比例常为1:200。肌酐Jaffe氏法监测时间短、吸光度值较低,样品试剂比例多为1:10。普通应以试剂说明为准,不宜轻易改动。
 
  (1)改动样品试剂比例,影响一系列方法学参数。若比例增大,则线性范围缩小,线性反应时间缩短,样品内源性干扰、基质效应添加、旁路反应会加强,方法特异性也下降。若比例减少,检测信号偏低,信噪比(乐音/信号)增大,当仪器精度不高时,会加大测量误差。
 
  (2)改动样品试剂比例,对某些反应有影响。如碱性磷酸酶(AI_P),有文献报道:当样品试剂比例从1:25降至1:50时,酶活力测定值添加,再低于1:50时不再添加。这一效应可能是较高浓缩度下AIJP多聚体解聚的结果。体液样品浓缩也可能对测定结果产生影响:④大多数蛋白质在浓溶液中的分子构象比稀溶液中波动,样品浓缩可影响酶的波动性。(2)降低样品中内源性抑制剂或激动剂的浓度,如以蒸馏水浓缩血清,可能因降低血清中淀粉酶的激动剂氯离子的浓度,致测定淀粉酶结果偏低;随血清浓缩倍数添加,肌酸激酶测定活力添加,可能与降低样品中AMt,、胱氨酸等内源性抑制剂有关。
 
  (3)双试剂时要兼顾R1、R2和样品三者的比例,尤其不宜改动试剂间的比例。R2要考虑仪器规定的加液小体积,同一试剂瓶死体积下分液量小而浪费大的经济成绩等。
 
  4.浓缩(水)量在加样或加试剂时,加入去离子水或可以的液体。它的次要用途有两个。一是用于浓缩试剂的浓缩,或样品、校准品的浓缩。二是在样品加量小的时候用来冲洗样品探针,减小携带误差;但用量不宜太多,以免浓缩试剂影响反应。要把浓缩水量纳入样品试剂比例和反应液总体积考虑。必要时,干粉试剂复溶也要考虑此要素。
 
  四、试剂空白(Reagentblank)监测参数
 
  无样品或以水代替样品在反应过程中观察试剂空白值或其变化情况,次要用于监测试剂质量及仪器波动性,利用试剂空白对试剂本身或反应漂移惹起的误差进行补偿,用以校正△A或△A/min。它与测定波长、光径大小、不同试剂及配方和样品试剂比例等有关,不可以盲目套用,必要时宜实际测定。
 
  1.试剂吸光度上限和上限定点监测试剂的吸光度。它常用规定波长及光径下的吸光度值表示。仪器的试剂空白检测点因仪器和测定方法的不同而有差异。起点法常在PO点读数,连续监测法常以反应监测起始点来判读。仪器在试剂空白检测及相关的校准测定时,若监测到超过此参数的限值,则提示试剂失效或校准有效。反应吸光度向上的试验取上限值:如Trinder反应以酚或2-羟-3,5-二氯苯磺酸等和4-氨基安替比林作用,生成红色素,试剂有一定的自发氧化,其试剂普通要求试剂吸光度上限≤0.1-0.4。以结合型硝基苯衍生物作为底物的ALP和GGT常要求≤0.6~0.8。反应吸光度向下的试验取上限值:如以NADH或NADPH为辅酶的ALT和Urea(紫外法)等试验,普通要求试剂吸光度上限≥1.0。
 
  2.试剂空白速率顾名思义,它是在反应过程中对试剂空白的变化速率作连续监测,其数值在样品测定结果中自动扣除。试剂中可能混有的其他杂酶或干扰物对试剂空白速率有影响。在酶促反应中,试剂空白速率也是试剂在监测过程中底物自发降解的结果。底物为还原型辅酶者,本身不波动而分解,多呈下降趋势;以硝基苯酚或苯胺的衍生物作底物,在碱性环境中自发水解成被测物质,多呈上升趋势。此参数次要用于连续监测法。普通认为酶活性测定的试剂空白速率(△A/min)应≤0.001~0.003。由于试剂空白速率与仪器检测上限、正常参考范围上限等目标有关,有时也以浓度单位表示。要根据K值、仪器波动性、方法允许变异而定。例如,ALT或AST40U/L以下活力浓度的分析误差应≤10%,其试剂空白速率应≤4.0U/L。一些仪器的程序参数中没有此参数,但我们应在试剂空白的测定材料中关注它,若材料波动大,须查找试剂或仪器缘由。
 
  3.试剂空白的日常监测测定方法设置了试剂空白的项目,都要先行作试剂空白测定,在样品测定计算中自动扣除。由于试剂空白不是在每一个样品测定中实时测定并扣除,当样品测定中试剂的变化在未达到参数设置限值时不易发现,试剂空白扣除会产生误差。所以,应根据试剂的波动性确定试剂空白及相关的校准的测定频率。连续监测法的试剂应每天(尤其在换另瓶或另批号试剂时)常规测定此参数。对样品的异常结果.也应及时对其测定吸光度材料(包括与试剂空白有关的材料,例如PO点读数)观察分析。
 
  4.有的半自动生化仪没有试剂吸光度上限和上限设定,但普通在测定屏幕都显示初始吸光度值,应人工加以判断。酶活力测定结果呈负值,有时可能与试剂空白错误有关。
 
  5.试剂吸光度上限和上限不是试剂质量的指针。因此,一定的校准频率和室内质控是质量保证的必需手段。我们在实际工作中就遇到酶活力测定的试剂空白数据在规定限值内,但质控物测定结果连续偏低,病人结果因每天标本少而难以判断,后发现是试剂质量下降。
 
  五、波长的选择及测定模式
 
  波长(Wave1ength)的正确选择有利于提高测定的灵敏度和减少测定误差。光度学方法有单波长和双波长之分,有的仪器可用三波长、甚至少波长,以及两波长比率等。有的仪器可作导数光谱分析。单波长测定易受样品溶血、黄疸、脂浊等要素干扰。双波长测定可以通过副波长加以修正,减少甚至消弭干扰要素,提高测定精确性。采用同光束双波长,亦有利于排除光源强度变化对结果的影响。
 
  1.测定波长选择有三个次要条件:
 
  (1)待测物质在该波长下的光吸收大。
 
  (2)其吸收峰宜较宽而钝,而不是处于尖峰或陡肩,普通不选光谱中的末端吸收峰,换句话说,该吸收峰处的吸光度随波长变化较小。
 
  (3)常见干扰物在该波长下的光吸收小。试剂盒说明普通已提供波长参数。实际波长选择需求了解待测物质和干扰组分对不同波长单色光的吸收程度,即以波长为横坐标、吸光度为纵坐标作吸收光谱曲线(光吸收曲线)。
 
  采用透射免疫比浊法,免疫复合物大小约35~100mn之间,于波长290~410nm下有大吸收峰,常取340nm;如用胶乳加强免疫浊度法,理想的检测波长可增至可见光区。
 
  2.双波长测定当待测物质与干扰组分的吸收光谱互相堆叠、出现非特异光吸收,或因反应液混浊出现光散射时,可以采用双波长(或多波长)测定。双波长测定的准绳是根据干扰组分和待测物质吸收光谱的峰形特征,选择两个波长和,使干扰组分在这两个波长处的吸光系数相等,而使待测物质在两波长处的吸光系数有明显差别。以两波长分别测定分析溶液的吸光度,以两个吸光度值之差(△A)计算。双波长选择常见:血红蛋白340nm和380nm波长吸光度相反,以NADH或NADPH作为测定底物或产物的试验常采用340/380nm;有的也.采用340/405nm。ALP和GGT常使405/476nm,Trinder反应多选取520/600nm或550/660nm.免疫比浊常选用340/700nm等。
 
  连续监测法中,要留意双波长测定有两品种型的机型:主波长全程监测副波长单点监测,和双波长全程监测。不只由于后者的精确性优于前者,而且由于酶活性测定的K值计算与波长及摩尔吸光系数有关,更显重要。
 
  副波长单点监测:试剂和样品混合后,双波长只测一点,此后只用主波长连续监测;计算时,全部x主吸光度值均减去同一λ副吸光度值。K值计算代入主波长摩尔吸光系数即可。机型如Monarch1000,TechniconRA1000等。
 
  双波长全程监测:全程每~测定点均用双波长同测,并各自用λ主吸光度值减去λ副吸光度值。由于所测指示酶或产物在λ副波长时也存在一定的吸光系数,K值计算代入的摩尔吸光系数值应采用ε主减去ε副。如NADH的ε为6.22×10,为1.33×10,ALP产物ε为18.5x×10,ε为0.2×10很小;GGT产物在副波长处无吸光系数。

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